1．鸡传染性法氏囊病病毒B细胞抗原表位的研究

　　鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease, IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的鸡的一种高度接触性传染病。病毒在法氏囊的B淋巴细胞中迅速繁殖，损伤法氏囊的B淋巴细胞，引起严重的免疫抑制，从而导致疫苗免疫失败和继发感染的发生，对养鸡业造成严重的经济损失。IBDV属于双RNA病毒科的成员，病毒基因组由A，B两个片段的双股RNA组成。其中，基因组B片段编码病毒蛋白VP1，它是一种RNA依赖性的RNA聚合酶；基因组A片段包含2个部分重叠的开放阅读框架（ORF），小ORF编码分子量为17kDa的非结构蛋白VP5；大ORF编码一种分子量约110kDa的前体多聚蛋白，该蛋白在翻译后进一步加工形成VP2、VP3和VP4，形成IBDV的结构蛋白，参与病毒核衣壳的形成，携带病毒主要中和性B细胞抗原表位，诱导中和性抗体的产生。

　　B细胞抗原表位又称抗原决定簇，是抗原分子上能够被抗体分子识别的部位，在蛋白质抗原中一般由几个直接相邻或构象上相邻的氨基酸组成，决定着机体产生抗体的特异性，是诱导体液免疫的基本单位。对以体液免疫反应为主IBDV来说，鉴定其B细胞抗原表位便是揭示IBD体液免疫的本质。

　　本项研究应用基因工程技术构建了VP2和VP3基因原核表达载体pETVP2和pETVP3，并在大肠杆菌中诱导表达了鸡IBDV主要结构蛋白VP2和VP3。表达蛋白能够与鸡IBDV抗血清特异性反应，应用该表达蛋白鉴定出11株单克隆抗体识别VP2蛋白，2株单克隆抗体识别VP3蛋白。

　　然后，在应用生物信息学原理分析鸡IBDV VP2-4-3蛋白结构特性的基础上，合成了VP2 16-mer 重叠多肽51条，VP2 12-mer 重叠多肽 64条，VP3 20-mer 重叠多肽28条，VP3 12-mer 重叠多肽30条，VP4 12-mer 重叠多肽33条。合成多肽与载体蛋白BSA偶联后，经peptide-ELISA和Dot-ELISA检测其与鸡IBDV单克隆抗体或多抗的反应性。结果显示，VP2中含有5个中和性单克隆抗体识别的线性表位：EP1: 37tlrsetstynltv49；EP2: 76sngnykf82；EP3: 201drprvytitaaddyqfs217；EP4: 326swsargslavti337；EP5: 403serdrlgikt

vw414和6个多抗反应位点：ES1: 91nlpasynycrlvsrsltv108；ES2: 331gs

lavtihggnypgalrpvtlv352；ES3: 371felipnpelaknlvteyg388；ES4: 433nsplkiagafgfk445；ES5: 449rairriavpvvs460；ES6: 495asgkaraas

grirqltla512。VP3中含有2个中和性单克隆抗体识别线性表位：728prdwdrlpylnl739；982pkpkpkpnaptq993和4个多抗反应位点：ES7: 818lanapqagsksqra831，ES8: 851qrekdtriskkmetmgiyfatp872， ES9: 876alnghrgpspgqlkywqntrei897， ES10: 961qmkdlllta memk

973。VP4中含有2个多抗识别位点：ES11: 531vvdgilaspgvlrgahnldcvlr

egatl558，ES12: 593psqrgsfirtlsghrvygyapdgv616。VP2和VP3单克隆抗体识别的抗原表位多肽同时也能够与鸡IBDV多抗血清反应。

　　应用噬菌体展示的随机7肽库对鸡IBDV VP2蛋白中和性单克隆抗体YNW17和YNW29进行生物淘选，单克隆抗体YNW17和YNW29识别噬菌体展示外源多肽的基序分别为D-X-P-R和A-R-G。序列比对分析这两株单克隆抗体识别的多肽基序分别位于VP2氨基酸201-204和329-331。通过重叠多肽合成技术和单克隆抗体抑制实验证明单克隆抗体YNW17识别VP2表位的氨基酸序列为：197Cdssdrprvytit209；单克隆抗体YNW29识别表位的序列为：329argslavti337。进一步精确定位了表位EP3和EP4的序列范围。应用单克隆抗体YNW17和YNW29识别的表位多肽197Cdssdrprvytit209和327wsargslavtihg339与载体蛋白KLH偶联后，免疫小鼠能够产生针对其多肽本身的抗体，该抗体能够在鸡胚成纤维细胞上中和鸡IBDV血清I型病毒的增殖。通过本项研究，详细地绘制了鸡IBDV VP2-4-3蛋白的抗原表位图谱，对揭示IBDV体液免疫发生的本质具有重要意义，同时为设计IBD新型表位疫苗奠定了基础。

　　2．传染性法氏囊病病毒受体基因克隆

　　构建了鸡法氏囊B细胞cDNA噬菌体文库。提取鸡法氏囊B细胞mRNA，合成cDNA，通过接头与T7噬菌体DNA左右臂相连，经过体外包装，形成重组噬菌体，构建鸡法氏囊B细胞cDNA噬菌体文库，文库容量为1*107 PFU，重组率达80以上。

　　初步克隆鉴定了鸡传染性法氏囊病病毒受体基因。以纯化鸡传染性法氏囊病病毒进行Biopanning，经过多轮淘洗，筛选与鸡传染性法氏囊病病毒蛋白特异结合的重组噬菌，获得3个鸡法氏囊B细胞cDNA片段，并克隆鉴定其全长cDNA，该cDNA编码蛋白与鸡传染性法氏囊病病毒的结合特性及功能正在鉴定中。

　　3．牛IgG Fc受体的配体结合表位鉴定

　　牛IgG Fc受体胞外区重组蛋白的表达和纯化。分别将牛IgG Fc受体(boFcγ2R、boFcγRIA和boFcγRIIA)胞外区基因克隆到原核和真核表达载体，并在大肠杆菌和NS0细胞中表达，以镍螯合亲和层析纯化表达蛋白。Dot-blot和ELISA结果表明，重组蛋白具有良好的生物活性。

　　稳定表达牛IgG Fc受体细胞系的建立。将牛IgG Fc受体(boFcγ2R、boFcγRIA和boFcγRIIA)全长基因克隆到真核表达载体pcDNA3，转染COS7细胞，以G418进行选择性培养，牛IgG致敏鸡红细胞进行玫瑰花环试验，检测受体在转染细胞表面的表达，经过连续克隆化，获得稳定表达牛IgG Fc受体的转染细胞系，建立了研究上述三种受体功能的技术平台。

　　鉴定了四类牛IgG Fc受体的线性配体结合表位。设计合成四类牛IgG Fc受体多肽，偶联于载体蛋白(BSA)，建立Dot-blot检测方法，筛选到与牛IgG特异结合的受体多肽，将受体的线性配体结合表位分别精确定位在4-10氨基酸，并通过氨基酸突变，鉴定了该结合表位的关键氨基酸残基，为新型药物的分子设计和开发提供理论指导。