云南农业大学动物科技学院　王晓通　娄义洲 　　摘要:本文综述了转基因家禽(主要是转基因鸡)的应用领域、基本原理和方法 　　关键词:转基因；家禽；应用领域；基本原理；方法 　　转基因技术的发展令人瞩目，其中植物、微生物转基因技术成果已经产业化，为人类带来了巨大的经济效益。转基因动物特别是转基因家禽由于具有更为优秀的生产能力和良好的市场前景，从而成为国内外研究的热点。本文以鸡为例针对当前转基因家禽生产的应用领域、基本原理和方法作一介绍。 　　1 转基因鸡的应用领域 　　转基因鸡的研究在动物育种、生物制药等方面的应用价值具体表现在以下几个方面： 　　1.1 加快QTL选择进程 在某些情况下，转基因家禽可以作为验证侯选数量性状位点假设的一种方法。比如，我们已经通过某种分子标记从整个鸡的基因组中确定下了某几个位点中的一个或部分为某一性状的QTL，这时我们就可以对这几个位点进行顺序突变，然后根据表型，逐个排除，最终确定主效基因。但是，进行突变或有巨大效应的单个基因插入到基因组后，可能会产生一系列不利的表型反应，如同在高选择强度下对单个性状选择时经常表现的那样，这样可能会给我们的研究过程带来不便，比如，很高的死亡率，整体功能的失调等，这些都会影响性状的表现(严华祥,1994)。但是，随着基因组功能研究的深入，许多负表现会被克服，转基因方法可能会取代传统的选择方法。 　　1.2 提高肉蛋的产量与质量 可以通过转基因操作将作用显著的激素和生长因子的基因导入鸡的基因组或对某些生产性能不利基因进行敲除，从而大大提高其产量。如把反刍动物小肠细胞中的纤维素酶基因导入鸡体，使鸡体可以分解多糖，这样，就产生了食草而产蛋长肉的鸡，并且增加了鸡的饲料来源(陈汉源,1999)。 　　1.3 进行抗病育种 应用基因剔除技术破坏鸡体内源的病毒受体基因，可以防止病毒侵入。也可以通过标记辅助选择技术找出与鸡的抗病特性相关的位点，然后进行PCR扩增，再通过适当的方法导入鸡的胚胎细胞，并使用酶切技术对其同源序列进行替换，然后进行胚胎培养，最后结合数量遗传学的方法进行抗病品系培育。 　　1.4 生产医用、保健蛋白 继乳腺生物反应器之后，转基因鸡生物反应器又成为新的热点。通过转基因技术导入人和动物各种抗体的基因，用来防治人和动物的疾病。另如，又可将SOD基因和人瘦素蛋白基因导入鸡的基因组中，然后从鸡蛋中提取有效成分，用来生产化妆品和保健品。因为转基因鸡有着其特殊的优越性，故利用转基因鸡生产药物的研究已受到国际上的极大关注和重视，必将产生极大的经济与社会效益。 　　2 基本原理 　　2.1 蛋的形成 作为鸡转基因操作的主要场所和外源基因产物的载体，对蛋的形成过程有必要作一番了解。从母鸡前次产蛋时间起，24 min后，卵巢排卵。排卵后3?35 min卵子进入漏斗部。禽类是多精入卵，但只有一个精子与卵结合，精子入卵时，卵子处于第二次减数分裂中期，精子入卵后，卵子排出第二极体，形成雌原核；此时，精子头部膨大，形成雄原核，雌雄原核结合，完成受精过程。禽类的卵在输卵管漏斗部受精后，在输卵管内向泄殖腔方向移动。在卵的膨大部形成卵系带和浓蛋白，然后进入输卵管的峡部。在输卵管的峡部，首先由管壁腺体分泌形成的蛋白纤维覆盖于浓蛋白之外，形成内壳膜，然后在峡部继续移动，形成第二层较厚的蛋白纤维层，即外壳膜；在子宫部形成蛋壳、蛋壳色素以及稀蛋白的水分，最后进入阴道部，再通过泄殖腔排出体外。 　　2.2 胚胎系统的建立及发育 针对于转基因的制作，着重介绍一下原生殖细胞（PGCs）起源及迁移。原生殖细胞（PGCs），就是指能发育为精子或卵子的祖先细胞。鸟类PGCs来源于上胚层，即第Χ期胚胎明区的中央带细胞群。至于来源于上胚层的那一部分，视鸟类的种类不同而不同。PGCs从Ⅻ期开始由上胚层向下胚层迁移。迁移下来的PGCs由下胚层或中胚层携带进入生殖新月区，故生殖新月区和内胚层是PGCs的第二停顿地方，随着胚胎发育到第Ⅺ至第Ⅻ期，PGCs首先在上胚层聚集，然后迁移至下胚层，孵化18 h左右PGCs迁移至原条期的生殖新月区处。第Ⅻ期胚胎循环系统开始发育，大致在孵化72 h左右时原始生殖细胞随着血液迁移到生殖脊。经过4 d左右的迁移，原始生殖细胞全部位于生殖脊处。PGCs从生殖新月区向生殖脊原基的迁移过程，可分为分离期、迁移期和安置期3个阶段。其中，PGCs迁移的机制有以下3种：第一，生殖脊皮质能够分泌一种糖蛋白物质，这种物质具有吸引原生殖细胞向生殖脊迁移的能力，并且这种吸引力在较远距离仍没有物种的区别。鸡胚的性腺能吸引来自火鸡，甚至小鼠循环血液中的原生殖细胞。第二，在体内正常的情况下，PGCs通过毛细血管内皮的间隙进入内脏壁中胚层。PGCs首先粘附于血管内皮表面，然后产生一个膨大的伪足穿过内皮缝隙，运动到脏壁中胚层之中。第三，所有羊膜动物的PGCs均通过背肠系膜运动而达到生殖腺原基。最早从上胚层迁移下来的PGCs首先到达正在扩展的下胚层上，于Ⅻ-ⅩⅢ期随着下胚层以离心方式扩展而被动地被携带迁移进入生殖新月区。在明区的前端边缘地带组成该生殖新月区的外胚层基膜上有一纤维区域，鸡胚PGCs就粘附在位于明区边缘上胚层的基膜上的纤维状条带区，并顺着它迁移。迁移到生殖脊后，精原细胞直到性成熟即精子开始生成之时才开始增殖；对于雌性的生殖细胞，卵母细胞在孵化前或出生后便进入分裂停止时期，直到性成熟还保持静止状态。 　　2.3鸡作为生物反应器的优势 鸡作为生物反应器具有其它哺乳动物所具有的的优点：第一，对鸡自身具有安全性。鸡的输卵管是一个自我封闭的系统，肝脏合成蛋黄中的蛋白质和脂肪，并由血液直接输入输卵管。输卵管的漏斗部、膨大部分泌蛋白，特别是膨大部具有丰富的腺体组织。分泌大量蛋白。输卵管中的蛋白蛋黄不会再回到血液中去，这样可避免大量表达的外源性蛋白对鸡健康造成的危害；第二，鸡的输卵管是有效的蛋白合成器；第三，卵清蛋白启动子可诱导人类珍稀蛋白的表达并对其进行正确的修饰和加工。产物的生物活性接近天然产品；第四，鸡输卵管表达外源蛋白可稳定遗传，一旦获得可生产有价值蛋白的动物个体。可用常规畜牧技术建立转基因鸡的家系，且建群也相对容易些。鸡作为生物反应器还具有哺乳动物所不具有的优点：第一，产物易收集，且产物的取得不影响鸡本身的健康，产物也不易污染。第二，鸡蛋中成分简单，产物易分离。第三，鸡饲养成本低，费用消费低。第四，时代间隔短，实验时间短。 　　2.4 鸡作为生物反应器目前所不能克服的缺点 禽类的胚胎发育与哺乳类相比较有很多不同点，对它的研究暂时落后于其它动物，使得转基因鸡的应用仍存在较多困难：第一，不易获得大量的受精卵；第二，受精时多精入卵的干扰，使雄性原核不易识别；第三，卵子重新移入母体输卵管内的技术或受精卵体外孵化技术难度大，致使在哺乳动物中已经广泛应用的转基因技术，不适合在禽类中应用。 　　3 转基因禽类的制作方法 　　3.1 通过显微注射生产转基因鸡 　　3.1.1 单细胞受精卵显微注射法 人们发现，当外源DNA注射到海胆、斑马鱼和爪蟾等脊椎动物受精卵细胞质中，当卵快速分裂时，外源DNA能暂时停留染色体外复制，并可低频率地结合到染色体基因组中。得益于上述研究的启示，在体外将外源基因注射到单细胞受精卵细胞质中，经过体外培养后，成功地产生了转基因鸡。但是，此种方法取到一个受精卵需要一只母鸡，若操作失败，一个细胞的损失就相当于一只母鸡的损失，成本较高，并且受精卵体外孵化条件也很复杂，操作难度较大。 　　3.1.2 受精卵原核注射法 在国内，李赞东等将脂质体包装后的质粒pMiwz（含有报告基因LacZ）注入囊胚期胚盘中，转基因获得成功，并证明囊胚期注射外源基因可以获得转染的原生殖细胞（PGCs）,并能够传给下一代。在国外，Jamie Love等将带有目的基因质粒DNA注射入鸡受精卵的胚胎中，体外培养12 h后发现近一半存活，40%胚胎中含有质粒DNA，有6%相当于每一个细胞含有1个拷贝的外源基因，7只存活至性成熟雏鸡中的一只将3.4%外源基因传递给其后代。此种方法可以得到转基因嵌合体鸡，但转基因细胞的嵌合部位和嵌合程度不容易确定。 　　3.2 鸡卵原始胚细胞的弹道转染 该技术最初应用于植物细胞的转基因操作，其中包括两大组成部分：离子加速系统和离子包装系统。白占涛、王跃嗣等曾成功的用牙科无针头注射器将质粒DNA送入鸡胚。其过程如下：使用平均直径在1.5微米的钨离子，待孵化两天后，揭掉0.5cm2外壳，然后将外包DNA的微粒射入暴露出的胚性新月，将洞口封好，把卵送回孵化器。此种方法效率较高，并且由于用的是不同大小的钨离子，而且胚胎新月区下主要是卵黄蛋白，所以不必考虑投射弹的速度和穿入的深度(白占涛等,2000)。鸡胚胎所具有的一系列特点使它更适合于弹道转染：第一，鸡胚材料易得；第二，鸡胚恰好位于外壳下，蛋黄表面；第三，位于胚性新月区的原始胚细胞在发育到12胚龄时易于鉴别；第四，胚性新月是外胚性的；第五，由于胚性新月区下仅有少量细胞，所以在弹道转染时对胚胎组织的伤害很小。但是，由于此方法导入的DNA很难整合到鸡的基因组中，故遗传稳定性和传代性不强。 　　3.3 逆转录病毒载体法 此法是利用病毒正常生命周期特征来感染家禽，从而导入外源并达到整合的目的。现在使用的病毒载体有两类：复制完全型和复制缺陷型(高波,2000)。复制完全型逆转录病毒包含全部结构基因能自我复制，并能重复感染细胞。而复制缺陷型逆转录病毒缺乏部分或全部结构基因，不能自我复制，需在辅助细胞中繁殖，其原理是：将缺失包装信号的辅助病毒核苷酸序列转染进细胞核，这样就产生了辅助细胞，这种细胞可产生所有的病毒成分，但由于缺少包装信号，故不能形成病毒颗粒，但其含有的完整的病毒成分是合成感染性颗粒外壳所必需的；载体是通过保留包装信号而缺失大段病毒基因组产生的；外源基因就是插入到有缺失的逆转录病毒基因组中，并一起转染进辅助细胞；这样，载体中的包装信号利用辅助细胞中的辅助病毒基因序列共同合成了辅助病毒外壳，即感染性颗粒的外壳；因为它含有包装信号，所以能侵染新细胞，又因为它缺失了产生新的病毒颗粒所需要的部分遗传信息，所以不能进一步复制成病毒颗粒。反转录载体法的整合效率比电穿孔和脂质体转染法要高，但是由于基因片段大小的限制和获得高滴度病毒有困难，所以目前主要停留在实验室阶段，还未广泛应用于商业生产(刘向萍，2003)。 　　3.4 精子载体法 这种方法利用精卵结合的正常生理过程来完成外源基因的导入,具有简便易行,对卵原核无损伤等特点，但对精子的损伤是十分棘手的问题，并且整合度也不高。 　　3.4.1 脂质体介导精子载体法 在国内,杜立新等曾对此方法作过探讨,其大体实验步骤包括:脂质体-DNA复合的制备、mDm-His法获能精子的人工授精、转基因鸡的检测。发现的问题是精子活力下降、外源基因表达率随胚胎发育而降低等问题。增加脂质体制品中脂质的浓度能增加脂质体与DNA的结合效率,但降低DNA向精子的转移效率；给脂质体中加入SA（硬脂酰胺）能促进DNA与脂质体的结合效率,并促进DNA向精子的转移；而同时含有LPC(二月桂酰溶血卵磷脂)和SA时,含DNA的精子的转移水平最高,且不影响精子的受精能力(白占涛等,2000)。 　　3.4.2 精子细胞电穿孔法 电穿孔法是促进DNA与动物精子结合的一种重要方法.它利用高压电场使精子质膜产生暂时性孔洞,从而使外源DNA比较容易地进入细胞内。此法用于牛精子和猪精子可使精子摄取DNA的数量增加5-10倍，体外受精后经PCR技术分析有22%左右的胚胎携带外源基因（马雪莲，2002）。此法应用于转基因鸡的研究，应该具有一定的可行性，钟家玉等曾经做过电脉冲作用将外源基因导入鲫鱼精子的研究，发现不同的电脉冲作用对精子有不同程度的损害作用，故我们可以通过实验得到一种适用于鸡精子的最佳脉冲，从而达到提高载体精子活力的目的。钟家玉还发现，先让精子脱水再水化或者对浸浴在外源基因中的精子进行电脉冲，得出的阳性率都比仅仅将外源基因和精子混合大得多。先脱水再置于低渗液，精子会吸入低渗液，而正是这一过程使阳性率大大提高，外源基因非常可能随着低渗液进入精子。 　　3.5 胚胎干细胞原生殖细胞操作法 胚胎干细胞（ES）是从早期胚胎的内细胞团经体外培养建立起来的多能细胞系。当ES被注入X期囊胚后可参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成,通常利用反转录病毒载体、电击法等将外源基因导入ES细胞中,将有功能的转入基因整合到ES细胞基因组内的非必需基因位点上,经筛选、培养，而后用于转基因鸡生产。为提高供体生殖细胞进入受体生殖腺的机率，事先用γ-射线照射受体胚盘，然后注入供体胚盘细胞，使供体后代的比例上升（李碧春等，2001），这样有利于转基因动物的传代及转基因纯合体的选育。原生殖细胞（PGCs）就是指能发育为精子或卵子的祖先细胞。生殖腺皮质能够分泌一种糖蛋白物质，这种物质具有吸引原生殖细胞向生殖脊迁移的能力。而对做转基因鸡和挽救濒危鸟类最为重要的是，PGCs在异种生殖腺中可以生存，并能分化为配子，这样我们就可以收集供体PGCs，对其进行转基因操作，然后通过血液注射导入供体制成嵌合体鸡。然而，目前面临的直接问题是PGCs获得量太少。 　　4 问题与展望 　　尽管转基因鸡的巨大商业与科研价值向人们展示了其美好的前景，但仍存在着许多问题，如目的基因在宿主染色体中的整合问题、逆转录病毒对鸡体存在潜在威胁、目的基因在鸡体中特异性表达不足和传代性不强等。因此，有人说转基因鸡的制备是一个长期过程其效益的产生更是虚无缥缈艰苦漫长，但从目前的研究成果来看，在不远的将来进行商品化生产还是有希望的，因为转基因鸡纵然不能传代,但仍有利用价值,因为其一代的生产效益已经相当可观。按每只母鸡平均每年产蛋200个、每个蛋中含人体蛋白100毫克来算，转基因鸡的利润已是相当丰厚。以复旦大学黄伟达教授为首的课题组已经有了较大进展，并且已迈向了产业化进程，成立了我国第一家转基因鸡产业开发公司；据新华社消息，在最近5年时间里，国际上至少己出现了9家从事转基因鸡产业化开发的公司，而开发时间比转基因鸡早的转基因牛技术，也不过有10多家产业化公司，这也从另一个方面说明了转基因鸡的巨大潜力。我们可以相信，随着转基因鸡研究的深入，转基因鸡的产业化开发必将大有可为。